Ni Seplife® 6FF (IDA) Affinity Chromatographic Media

دستورالعمل تست Ni Seplife® 6FF (IDA) Affinity Chromatographic Media

رزین Ni Seplife® 6FF (IDA) Affinity Chromatographic Media یک بستر پیشرفته کروماتوگرافی تمایلی بر پایه آگارز است که با اتصال گروه‌های IDA و یون‌های نیکل (Ni²⁺) برای جداسازی و خالص‌سازی پروتئین‌های دارای برچسب هیستیدین (His-tag) طراحی شده است. این رزین با پایداری بالا و ظرفیت اتصال مناسب، در فرآیندهای زیست‌فناوری و تولیدات بیودارویی کاربرد گسترده‌ای دارد. در ادامه مراحل آماده‌سازی، بارگذاری، شست‌وشو و نگهداری این رزین به‌صورت دقیق آورده شده است.

بسته‌بندی ستون

• تمام مواد و بافرها باید در دمای محیط آماده شوند.
• رزین را با بافر به نسبت 3:1 همگن کرده و گاززدایی کنید.
• اطمینان حاصل شود که درون و کف ستون مرطوب است و هیچ حبابی وجود ندارد.
• رزین را به‌آرامی از دیواره داخلی ستون وارد کرده تا ته‌نشینی یکنواخت انجام شود.
• بافری به میزان 2–3 BV با دبی 1.33× نرخ جریان عادی برای تعادل ستون عبور دهید.

تعادل‌سازی ستون

ستون را با 2–5 BV از بافر اولیه شست‌وشو دهید تا هدایت الکتریکی و pH به حالت پایدار برسند.

بارگذاری نمونه

• نمونه معمولاً در بافر با pH بین 6–8 حل می‌شود.
• از بافرهایی که حاوی EDTA یا سیترات هستند استفاده نکنید.
• بافرهای متداول شامل 10–100 mmol/L sodium phosphate و 20–200 mmol/L Tris-HCl می‌باشند.
• افزودن 0.15–0.5 mol/L NaCl برای حذف اثرات تبادل یونی توصیه می‌شود.
• برای اولین استفاده، بافر اولیه 50 mmol/L PBS (شامل 50 mmol/L NaH₂PO₄, 0.5 mol/L NaCl, pH 7.4) پیشنهاد می‌شود.

الوشن (Elution)

فرآیند الوشن یا جداسازی نهایی پروتئین از رزین به سه روش انجام می‌شود:

• الوشن با کاهش pH: بیشتر پروتئین‌ها در محدوده pH 6–4 و گاهی تا pH 3–4 آزاد می‌شوند. از بافرهای فسفات، استات یا سیترات استفاده می‌شود.
• الوشن رقابتی: افزایش غلظت موادی با تمایل به اتصال به یون نیکل مانند 0–0.5 mol/L imidazole، 0–50 mmol/L histidine یا 0–2 mol/L NH₄Cl.
• الوشن با عامل برهم‌زن فلز: استفاده از موادی نظیر EDTA یا EGTA که با یون نیکل واکنش داده و باعث آزاد شدن پروتئین می‌شوند. توجه شود این روش برای تفکیک پروتئین‌های مشابه توصیه نمی‌شود.

نکات کلیدی الوشن

• در نخستین استفاده، غلظت‌های مختلف 10–500 mmol/L ایمیدازول را به‌صورت مرحله‌ای آزمایش کرده و نتایج را با SDS-PAGE بررسی کنید.
• به دلیل خاصیت بازی ایمیدازول، pH با HCl تنظیم شود.
• در صورت کاهش pH، یون‌های نیکل ممکن است جدا شوند؛ پیش از استفاده مجدد، باید رزین دوباره با نیکل فعال گردد.
• افزودن 150–500 mmol/L NaCl برای حذف تبادل یونی ضروری است.

احیا و بازسازی رزین

• برای حذف یون نیکل، ستون را با 5–10 BV آب مقطر، سپس 100 mmol/L EDTA و در پایان 0.5 mol/L NaCl شست‌وشو دهید.
• برای پاکسازی کامل ستون، از محلول 0.1–1.0 mol/L NaOH در دبی 50 cm/h به مدت 1–2 h استفاده کنید.
• پس از شست‌وشو، ستون را با محلول نمک نیکل با غلظت 0.1–0.3 mol/L مجدداً فعال کرده و سپس با آب مقطر شست‌وشو دهید.

CIP (شست‌وشوی در محل)

• برای حذف پروتئین‌های جذب‌شده: استفاده از 2 mol/L NaCl در 2–3 BV.
• برای حذف ترکیبات چربی و پروتئین‌های آب‌گریز: استفاده از 70% اتانول یا 30% ایزوپروپانول.
• برای حذف پروتئین‌های رسوبی: طبق مراحل احیا و بازسازی عمل شود.

نگهداری

رزین باید در محیط خشک، خنک و دارای تهویه مناسب نگهداری شود. دمای نگهداری بین 4–30°C در محلول حاوی 20% اتانول توصیه می‌شود. ستون‌های استفاده‌شده نیز باید در دمای 4–8°C و در همین محلول حفظ شوند.

احتیاط‌ها

• پیش از کروماتوگرافی، نمونه و رزین باید با بافر الوشن هم‌تعادل شوند.
• سطح بستر ستون باید صاف و بدون حباب باشد؛ در غیر این صورت، نیاز به نصب مجدد دارد.
• دمای ستون و بافر باید یکسان باشد تا از ایجاد حباب و افت عملکرد جلوگیری شود.
• در زمان الوشن، سرعت جریان باید یکنواخت و کنترل‌شده باشد.
• در تمام مراحل بارگذاری و الوشن، از خشک‌شدن بستر جلوگیری شود.